原價1000元一張膜，促銷價800元。 【實驗原理】： WesternBlot 印跡方法，又稱為**印記，是將獲得的蛋白質樣品通 過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質進行分離，并通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉印后膜上的靶蛋白進行特異性結合，再與經辣根過氧化物酶標記（偶聯）的二抗結合，*后用ECL超敏發光液試劑檢測。如果轉印膜上含有靶蛋白，經X光片曝光、 顯影后，則會在X-光片上出現特異性蛋白條帶。 Westernblot 實驗分為三個部分： 1． 樣品蛋白質的制備、 蛋白質含量測定 2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 3． 凝膠轉膜及其檢測 以提取細胞蛋白為例Western印記雜交實驗流程圖： 提取細胞總蛋白、測定含量 ↓ 制備SDS-PAGE膠 ↓ 蛋白樣品變性、電泳 ↓ 電泳轉膜 ↓ 封閉 ↓ 一抗 ↓ TBST洗滌 ↓ HRP標記的二抗 ↓ TBST洗滌 ↓ ECL試劑作用 ↓ X-光片曝光、顯影 ↓ 結果分析 細胞總蛋白的提取及含量測定 一、細胞總蛋白的提取 提取細胞蛋白多是利用將細胞裂解、破碎、使蛋白質釋放的原理。提取蛋白質的方法很 多。其目的都是要獲取高豐度、高品質的蛋白質,以滿足實驗需要。 在提取蛋白質實驗中要特別考慮到細胞裂解液的pH、去污劑的類型和濃度以及二價陽 離子、輔助因子等因素，同時為防止細胞內蛋白酶對蛋白質的降解，需在裂解液中加入蛋白 酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的種類很多，如PMSF(苯甲基磺酰氟)；金屬蛋白酶抑制劑乙二胺 四乙酸（EDTA）、乙二醇雙四乙酸（EGTA）；肽蛋白酶抑制劑：亮抑酶肽（leupeptin）、胃蛋白酶抑制劑A（pepstatinA）、抑蛋白酶肽（aprotinin）；甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮（TLCK）、 甲苯磺酰丙氨酰氯甲酮（TPCK）等，要根據具體情況具體選擇。 制備蛋白質樣品應遵循下述原則： 1．盡可能采用簡單方法進行樣品處理，以避免蛋白丟失。 2．細胞和組織樣品的制備應盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以防止蛋 白酶的降解。 3．樣品裂解液應該新鮮制備，并且分裝凍存于-80℃。切勿反復凍融已制備好的樣品。 （一）試劑 1．細胞總蛋白裂解緩沖液： 2．PMSF儲存液(100mmol/L)： 稱取PMSF 17.4mg，溶于1ml 異丙醇，分裝后儲存于 -20℃。 注意: PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不穩定，故應在臨用前再加入到細胞裂解緩沖 液中，使其終濃度為0.174mg/ml，如：1 ml 細胞裂解液中，加入10ul PMSF 儲存液. （二）儀器和耗材 冷凍離心機 無菌的Tip 頭、1.5ml及0.5ml 離心管 ， （三）實驗材料 Hela 細胞 （四）實驗步驟 1．細胞的預處理： 由37℃ CO2培養箱中取出于60mm 細胞培養皿中培養的Hela 細胞，（細胞數約為5 ×106），吸棄原培養液，用4℃預冷的1×PBS洗細胞表面3～4 次，以去除培養基中的血清 及死細胞，并盡量吸棄細胞培養皿中殘余的PBS。將洗滌后細胞直接凍存于-80℃冰箱，待 提取蛋白質。此方法可保存細胞至少兩周。（注：如果需要，當用PBS洗滌細胞后，不必-80℃冰箱凍存，可直接進行步驟2） 2．（由-80℃冰箱中取出細胞培養皿，將其置于冰上，） 向上述各培養皿中加100ul 含 PMSF的蛋白提取液，輕輕晃動，使裂解液均勻鋪于細胞表面。 3．冰浴40 分鐘（通常冰浴時間為30～60 min），期間晃動3-4 次培養皿，使其作用均 勻。 4．用Tip 頭集中蛋白提取液，將其收集入冰上預冷的1.5ml Ep 管中，4℃離心，12,000g ×20min。 5．將上清液小心移入預冷的0.5ml 離心管中（為避免反復凍融導致蛋白降解，可按需 要將其分裝使用），-80℃保存備用。 （五）操作注意事項 1．注意個人防護。PMSF 嚴重損害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進或通過皮膚吸 收有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，立即用大量水沖洗 2．所用離心機需提前預冷。 3．吸取蛋白上清液時，注意不要把沉淀吸上來。 二、細胞總蛋白含量測定： 蛋白質的定量，目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍法）、BCA法、Lowry法（Folin-酚試劑法）等。但各有優缺點，客戶可以根據具體情況選取。 本實驗僅以Bradford方法為例。 ㈠試劑 1.4mg/ml BSA 標準蛋白液：10μl/管，4℃保存。臨用前， 加入70μl生理鹽水，配制成0.5mg/ml。 2.5×Bradford 試劑 3．考馬斯亮藍G-250 使用液 a.考馬斯亮藍G-250 母液：稱取考馬斯亮藍G-250 100mg,溶于50ml 95%乙醇；加入 100ml85%濃磷酸(w/v)。過濾，4℃保存6個月。 b.考馬斯亮藍G-250 使用液（0.01%考馬斯亮藍G-250）： 取考馬斯亮藍G-250 母液15ml加蒸餾水稀釋至 85ml(臨用前稀釋 ) ㈡儀器 分光光度計及玻璃比色皿 ㈢實驗步驟 1.稀釋5×Bradford試劑：如欲配制15ml 考馬斯亮藍使用液, 則： 5×Bradford 試 劑3ml, 蒸餾水12ml,充分混合； 2． 稀釋BSA 標準品及制作標準曲線： 用生理鹽水或PBS將0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）標準蛋白液分別稀釋成0、2、4、 6、8、10ug/100ul(分別編號：1、2、3、4、5、6、)濃度； 3．向上述不同濃度BSA 管中分別加入1.5ml Bradford 使用液， 混合均勻后移至玻璃 比色皿中，于紫外分光光度計上測定595nm吸光度值（OD595），依據所得數據制作標準曲線； 4．稀釋待測蛋白樣品： 吸取細胞總蛋白樣品2ul，加入98ul 生理鹽水或PBS（總體積為100ul），混合均勻后 加入1.5ml考馬斯亮藍使用液，混勻后測定595nm 吸光度值（OD595）； 5．計算樣品總蛋白含量（ug/ul）： 根據標準曲線圖，找出樣品蛋白在圖中的位置，計算出蛋白含量。 （四）注意事項 1．制作的BSA標準曲線如不規律，應重新再做。 2．如果待測樣品濃度高（如組織提取物），可用生理鹽水稀釋10～20 倍后測定；如樣 品濃度低，可適當增加樣品ul數及減少生理鹽水或PBS 的ul 數 3． 比色皿的清潔：考馬斯亮藍不易被清水沖洗干凈，因此使用后的比色皿除用清水 沖洗后，還需用無水乙醇將比色皿浸泡數分鐘以脫色，而后分別用自來水、蒸餾水沖洗后備 用。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統，即只有分離膠的連續系統和既有濃縮膠又有分離膠的不連續系統.聚丙烯酰胺凝膠電泳在不連續緩沖系統中進行，具有把樣品中的復合物全部濃縮于極小體積的能力，大大提高了SDS-聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。當對蛋白質樣品要做SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，要在樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇的樣品處理液。SDS 即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+），是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級 結構；β-巰基乙醇是強還原劑，它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。電泳樣品加入樣 品處理液后，要經過高溫處理，其目的是將SDS與蛋白質充分結合，以使蛋白質完全變性和 解聚，并形成棒狀結構。樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料，用于控制電泳過程。另外樣 品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品凹 槽底部。當樣品上樣并接通兩極間電流后，凝膠中形成移動界面并帶動凝膠中所含SDS 多 肽復合物向前推進。樣品首先通過高度多孔性的積層膠，使樣品中所含SDS多肽復合物在分 離膠表面聚集成一條很薄的區帶（或稱積層）。 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯度。 SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按雙丙烯酰胺：丙烯酰胺為1：29配制，實驗表明它能分離大小相 差只有3%的多肽。借助于已知分子量的標準參照物(蛋白分子量Marker)，則可推算出多肽 鏈的分子量。 ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍 丙烯酰胺濃度（％）線性分離范圍（KD） 15 10～43 12 12～60 10 20～80 7.5 36～94 5.0 57～212 一、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液 | 4× 濃縮膠緩沖液(Stacking gel Buffer, pH 6.8) | 4× 分離膠緩沖液(Resolving gel buffer pH 8.8) | 10 ×SDS-PAGE電泳緩沖液 | 10× 蛋白電轉移緩沖液 (10 ×Transfer buffer) | 10× 封閉-洗滌緩沖液 | 2 ×SDS-PAGE Sample/Loading Buffer | 5×SDS-PAGE Sample/Loading Buffer (inhibitingdephosphorylation) | 10%SDS溶液 | 1.5 MTris-Cl pH8.8 | 1 MTris-Cl pH 7.4 | 1 MTris-Cl pH 6.8 | 1 MTris-Cl pH 8.0 |
（一）試劑配制 1．30% 丙烯酰胺（29：1）： 2．1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8 3．1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8 4．10%SDS（室溫保存）: 5．10%過硫酸銨（4℃保存）： 6．TEMED（N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺）：催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰 胺和雙丙烯酰胺的聚合； 7.Tris-甘氨酸電泳緩沖液(1000ml): 8．2×蛋白質電泳上樣緩沖液 9.蛋白質預染Marker （二）實驗儀器及耗材 垂直電泳槽 穩壓穩流電泳儀/電轉儀 蛋白變性用加熱儀器 無菌Tip 頭、 Ep管、碎冰 、注射器等 （三）實驗步驟 1．制備SDS-PAGE 凝膠 （1）準備SDS-PAGE凝膠用玻璃槽： 將兩條墊片放入兩塊特制玻璃板中間（其中一塊為凹形），用透明膠帶將兩邊及底邊封 嚴。確定灌制分離膠液面標志線（距樣品梳子底部約0.5-1.0cm處）。 （2）配制10%SDS-PAGE分離膠 (15ml)： 去離子水5.9ml 30%丙烯酰胺 5.0ml 1.5mol/LTris-Cl pH8.8 3.8ml 10%過硫酸胺 0.15ml 10%SDS0.15ml 取上述液體1ml,加入TEMED 3ul, 混勻后用其封凝膠用玻璃槽周邊 （3）灌制分離膠： 待封邊膠凝固后，在其余14ml分離膠液中加入7 ul TEMED，混合均勻，用吸管輕輕加 入凝膠玻璃槽中，使其液面至標志線位置（避免產生氣泡）。 （4）立即用0.1%SDS液覆蓋膠面（隔絕空氣,有助于凝膠聚合，使凝膠面形成平直）， 室溫放置約40分鐘至分離膠凝固。 （5）配制5%濃縮膠4ml（此步操作可在配制分離膠時同時進行）： 去離子水2.7ml 30%丙烯酰胺 0.67ml 1.0mol/LTris-Cl pH6.8 0.5ml 10%過硫酸胺（一周內使用） 0.04ml 10%SDS0.04ml TEMDE（臨灌膠前再加） 0.004ml （6）倒掉0.1%SDS覆蓋液，用去離子水沖洗分離膠表面3-4 次，以洗凈未聚合的丙烯 酰胺凝膠（避免在膠頂部或玻璃夾板中留有氣泡），并用吸水紙吸掉殘留的液體。 （7）將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入5%積層膠液（注意避免產生氣泡），插入樣品 梳，使液面至樣品梳上標志線位置，室溫凝膠約40 分鐘。 （8）輕輕拔去梳子，撕去封玻璃夾板用透明膠帶，將玻璃夾板“凹”面貼緊電泳槽， 兩側用夾子很好的固定在電泳槽上。用針頭式注射器吸取電泳緩沖液輕輕沖洗點樣孔，以去 除未聚合的凝膠。 2．樣品變性及電泳 （1）由-80℃冰箱取出提取的Hela細胞總蛋白樣品，立即插入冰中（減少蛋白降解） 待其融化。 （2）吸取細胞總蛋白樣品15ul加入0.5mlEP 管中, 每樣品管中分別加入5ul 4×蛋白 質凝膠電泳上樣緩沖液,輕輕混合，98℃變性5 分鐘，立即插入冰中，voltex 數秒，短暫 離心. （3）吸出變性蛋白液，貼緊加樣孔上方，將樣品輕輕加至凝膠孔中。 （4）將電泳儀設置成穩壓狀態，接通電源，將電壓調至80V使樣品通過濃縮膠（電壓 約8v/cm）。當染料進入分離膠后，將電壓調高到120V（約12v/cm), 繼續電泳使染料至分 離膠適當位置（4℃冰箱中進行電泳）,結束電泳。 3．注意事項 （1）設立必要蛋白質分子量標志物 （2）丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經毒性并容易吸附于皮膚，其作用具有累積 性。故稱量時應戴手套及口罩； （3）不同廠家的SDS可引起多肽的遷移圖譜變化較大，建議找出個人喜歡的某一試劑 級別并認準使用。 （4）一旦加入TEMED，應立即混旋并快速灌注入玻璃夾板。 （5）過硫酸銨會緩慢分解，應隔周新鮮配制; （6）在多余的樣品孔中加入適量的蛋白質電泳上樣液，將會有助于保持電泳系統的平 衡。 （7）正確連接電泳連線正、負極方向（負極在上，正極在下）以保證電荷由負極向正 極方向流動。 （8）凝膠玻璃板要定期做硅化處理:用氯仿或庚烷配成5%二氯二甲硅烷溶液，用其浸 泡或擦拭玻璃板，有機溶劑揮發時，二氯二甲硅烷即沉積在玻璃制品上。使用前用水反復沖 洗多次或于180℃烘考2小時。 凝膠轉膜及其檢測 凝膠電泳結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至固相支持物 上，然后分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。 用于Western印跡法的固相支持物有多種，NC（硝酸纖維素）膜較為常用。 本實驗采用NC膜作為固相支持物。 轉膜的方式有濕轉和半干轉，本實驗采用濕轉方法。 一、轉移電泳 （一）試劑 1．轉移緩沖液 2．考馬斯亮藍快速染色液(膜－膠10秒鐘可逆染色液 (P1601，MemStain) （二）儀器及耗材 1．轉移電泳儀 2．轉移電泳槽 3．NC 膜、剪刀、濾紙等 （三）實驗方法 1．NC 膜及濾紙的預處理： 剪裁與膠大小一致的NC膜，將其浸入1×轉移緩沖液平衡5 分鐘以上。（注意：必須保 證NC膜始終完全浸于轉移緩沖液中） 2．剪裁與膠同樣大小的6 層濾紙，用轉移緩沖液浸泡后待用； 3．取下電泳板，將其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夾板中的墊片及去掉 上層玻璃板，切除多余凝膠，將含樣品膠用1×轉膜液漂洗一次。 4．轉膜 ①將樣品膠與膜裝入標有正、負極的轉膜夾板中：由陰極側開始，依次為海綿墊片 →3層濾紙→樣品膠→NC膜→三層濾紙（注意：排除氣泡）→海綿墊片，扣緊轉膜夾板，放入含有轉膜緩沖液的轉移電泳槽中（見蛋白質轉移示意圖）。 ②正確連接轉移電泳連線，保證電荷由負極向正極流動。接通電源，恒壓狀態下，80v 轉膜2h（此步操作宜在4℃冰箱中進行）。 ③小心取出轉移膜，在1×TBST 液中漂洗兩次 ④用考馬斯亮蘭快速染液處理凝膠，檢查蛋白轉移是否完全。 （四）注意事項 1.選擇合適的轉移緩沖系統 2.為避免造成以后操作誤差，在轉移前將膜與膠做標記； 3.將轉膜夾板的負極側放在轉移電泳槽負極側，以確保樣品蛋白由凝膠轉移至NC 膜。 二．封閉、抗體孵育及曝光 （一）試劑 1．10×TBST 緩沖液 2．封閉液（5%脫脂奶粉） 脫脂奶粉5 克，1×TBST80ml,充分溶解后補1×TBST 至100ml。 3．一抗： 兔抗Actin 4．二抗： 羊抗兔IgG/HRP 5．ECL 試劑盒 | Super ECL Plus超敏發光液 (SuperECL Plus Detection Reagent) | Super ECL超敏發光液 (SuperECL Detection Reagent) | BCIP/NBT片劑(堿性磷酸酶WesternBlot顯色底物) |
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6．顯影、定影液 （二）實驗儀器及材料 1．搖床 2．避光盒、洗膜用平皿、X-光片、X-光片曝光盒等 | 聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置 | 聚丙烯酰胺凝膠干膠用透明薄膜 | 熒光和放射自顯影曝光標簽
是一種非同位素的自發熒光標簽，可粘貼在X-線曝光暗盒內、蛋白或核酸雜交印跡膜上或包被膜的塑料保鮮膜上；曝光顯影在X光膠片**顯示一條5厘米長的標尺和文字，幫助指示X-光膠片上的蛋白條帶位置、大小，以及指示顯影液是否失效。也可用作熒光成像系統的熒光標志或放射科X-線膠片曝光標志。是WesternBlot排憂解難的得力助手，并至少可以使用10年以上 | X線暗盒 | X光膠片高速增感屏 | 柯達X光膠片 |
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（三）實驗方法 1．封閉： 將轉移后的膜放入封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動狀態下封閉1h（ 或4℃ 過夜）； 2．一抗反應 ①將一抗（兔抗Actin）用封閉液稀釋500倍； ②將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應過夜。 3．洗膜 將反應膜放入平皿中，用1×TBST漂洗一次，繼而用1× TBST 洗滌三次，（室溫下緩 慢搖動洗滌）每次10分鐘，洗凈未結合的一抗。 4．二抗反應 ①將二抗（羊抗兔IgG/HRP）用1×TBST 稀釋2000 倍； ②將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中（室溫、避光緩慢搖動）作用50分鐘（不 超過60分鐘）。 5．洗膜 用1×TBST 洗膜，方法同“3”，洗去游離二抗 6．曝光及洗片： ①按1：1（v/v）混合ECL 試劑盒中兩種液體。 ②將上述混合液均勻鋪在NC 膜表面，室溫作用2 分鐘。抖掉膜上液體，將其放入鋪有 保鮮膜的曝光盒中，再將保鮮膜折疊，以包裹住NC膜（避免在膜的上面出現氣泡）。 ③在暗室中（紅光下）將X 光膠片直接壓于包裹后的膜上，曝光盒中曝光適當時間。 ④將曝光后X 光片放入顯影液中顯影、清水中漂洗、 定影液中定影1 分鐘（具體曝光 時間及顯影時間需根據顯影結果作出調整）。 （四）注意事項 1．選擇合適的一抗及二抗濃度 2．吸取ECL 試劑時要注意更換Tip 尖； 兩種試劑一經混合，應在30 分鐘內使用 ４．注意避光操作； ５．應考慮ECL試劑的發光強度極其衰滅時間，兩種試劑一經混合，應在規定時間內 |