小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒使用說明

(產品貨號：FS5300)

原理

本實驗采用雙抗體夾心 ELISA法。用抗小鼠Ig多抗包被于酶標板上，樣品中的 Ig與多抗結合，加入分別針對小鼠 IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM，kappa light chain，lambda light chain 的特異性抗體，形成**復合物連接在板上，加入酶底物TMB，出現藍色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm處測OD值，Ig濃度與OD值成正比，可通過顏色鑒定出標本中Ig亞型。

試劑盒組成（2-8℃保存）

準備試劑與收集血樣

1. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
2. 雜交瘤細胞上清 : 將樣本以 1× PBST 1:100 稀釋，例如 10 uL 雜交瘤細胞上清 + 990 uL 1×PBST。推薦稀釋范圍為 1:20-1:200。
3. 腹水 : 將樣本以 1×PBST 1:100000 稀釋，例如 1 uL 腹水 + 1 mL 1×PBST（1:1000），再取上述混合液 5 uL + 495 uL 1× PBST。推薦稀釋范圍為 1:50000-1:200000。
4. 純化抗體 : 將樣本以1×PBST 稀釋至 200 ng/mL，推薦稀釋濃度為 20 ng/mL-1 ug/mL。
5. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測程序

1. 加樣：每孔各加入待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃30分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。。
3. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。
6. 每孔加入100ul終止液混勻。
7. 30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。

結果計算與判斷

1. 結果判讀。結果可以對照下圖以肉眼判定，也可以通過酶標儀讀取 OD450。顏色*深或是 OD 值*高孔對應的即為相應亞型。

試劑盒性能

            1. 靈敏度：*小的Ig 檢測濃度小于6ng/ml。

2. 特異性：可同時檢測重組或天然的小鼠Ig。不與小鼠其它細胞因子有交叉反應。
3. 重復性：板內、板見變異系數均小于10％。

注意事項

            1. 以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。

2. 洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致**度誤差及OD值錯誤地升高。

            3. 檢測時所有試劑都要恢復到室溫。板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

            4. 試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過深會出現絮狀物，屬正常現象，不影響結果判讀。

            5. 說明書中試劑盒組成為96T的量，48T的量應減半！

6. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。僅用于科研，不能用于臨床診斷！