大鼠T-bet(T-bet)ELISA試劑盒

原理

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 T-bet 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 T-bet與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠T-bet，形成**復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，*后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，T-bet濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中T-bet濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）

準(zhǔn)備試劑與收集血樣

1. 10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
2. 收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時(shí)；更長時(shí)間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品液配制：取8個(gè)1.5ml離心管，**管加標(biāo)本稀釋液900ul，**至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在**管中加入20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul置于漩渦混合器上混勻后用加樣器吸出500ul，移至**管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對(duì)照。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

標(biāo)本激活方法

            1. 將320ul標(biāo)本稀釋液加入到一支1.5ml進(jìn)口聚丙烯管中,再加40ul血清或血漿或組織標(biāo)本。

2. 加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。

3. 加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。

4. 即用，或放-20/-70℃保存3天。計(jì)算結(jié)果時(shí)乘以稀釋倍數(shù)10。（注意：不同的標(biāo)本T-bet的水平可能有較大差異，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況靈活掌握稀釋度）

5. 細(xì)胞培養(yǎng)上清2倍稀釋(60ul的標(biāo)本稀釋液＋100ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。

6. 尿液直接活化1.4倍稀釋（100ul尿液＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH）

檢測程序

1. 加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品(已激活)100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃40分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。
3. 每孔加入蒸餾水和**抗體工作液各50ul(空白除外)。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃20分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃10分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。

結(jié)果計(jì)算與判斷

1. 所有OD值建議減除空白值后再行計(jì)算。如空白OD低于0.1，也可以直接計(jì)算。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，使用軟件作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 根據(jù)樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)T-bet含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。軟件可以向本公司郵件索取。

試劑盒性能

            1. 靈敏度：*小的T-bet檢測濃度小于15pg/ml。

2. 特異性：可同時(shí)檢測重組或天然的大鼠T-bet。不與大鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10％。

注意事項(xiàng)

            1. 以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致**度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。

            3. 檢測時(shí)所有試劑都要恢復(fù)到室溫。板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

            4. 試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過深會(huì)出現(xiàn)絮狀物，屬正?，F(xiàn)象，不影響結(jié)果判讀。

            5. 說明書中試劑盒組成為96T的量，48T的量應(yīng)減半！

6. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。僅用于科研，不能用于臨床診斷！